تحديد تتابع نيوكميوتيدات الدنا DNA- Sequencing تعد تقنية تحديد تتابعات الدنا واحدة من اىم تقنيات اليندسة الو ارثية فمن خالليا اصبح ممكنا التعرف عمى تتابع النيوكميوتيدات لقطعة دنا معينة بدقة بالغة ومما الشك فيو ان ىذه التقنية اضفت بعدا جديدا لعمم البايولوجي الجزيئي وكشفت الكثير من االس ارر التي تحيط بجزيئة الدنا كما امكن من خالليا التعرف عمى طبيعة العدبد من الجينات المكمونة وخواصيا. ىناك طريقتان رئيسيتان لتحديد تتابع النيوكميوتيدات طور االولى سنجر و كولسون Sanger and Coulson وتدعى طريقة ايقاف السمسمة chain termination اما الثانية فقد طورىا ماكسام وجمبرت Maxam and Gilbert ويطمق عمييا اسم طريقة التحمل الكيمياوي.chemical degradation تشترط االولى كمونة الدنا المرغوبة في احد النواقل المشتقة من العاثي M13 لمحصول عمييا بشكل خيط مفرد وىي اكثر استخداما من الطريقة الثانية اما الطرق الحديثة التي ابتكرت في العقد االخير المعتمدة كميا عمى اجيزه متطورة جدا وذات مواصفات خاصة اال ان اساسيا ال ي ازل يعتمد عمى ىاتين الطريقتين. اوال: تشترط سنجر طريقة و كولسون )ايقاف السمسمة(: and Coulson (chain termination): Sanger ىذه الطريقة ان تكون قطعة الدنا المرغوب تحديد تتابعاتيا عمى شكل خيط مفرد لكي تستخدم بمثابة قالب لبناء الخيط الثاني بواسطة انزيم DNA Polymerase لذا تكمون قطع الدنا اليدف في احد نواقل العاثي M13 لمحصول عمييا بشكل خيط مفرد مالئم الج ارء ىذه العممية. وتعتمد ىذه الطريقة عمى استثمار خاصيتين من خصائص انزيم DNA Polymerase االولى ىي قابميتو عمى بناء خيط جديد مكمل لمخيط المكمون )القالب( عن طريق اضافتو لمنيوكميوتيدات الجديدة واحدة تمو االخرى حسب قاعدة واطسن وكريك اما الخاصية الثانية فيي قابميتو عمى استعمال أوكسى نيوكميوتيداتnucleotides 3,2 dideoxy كمادة اساس في بناء الخيط الجديد وىي : ان ىذه المادة ىي من مشابيات مولدات النيكميوتيدات triphosphate (ddttp) الداى دى Dideoxy thymidine Dideoxy cytidine triphosphate (ddctp) Dideoxy adenosine triphosphate (ddatp) Dideoxy guanosine triphosphate (ddgtp) دى أوكسى نيوكميوتيدات dideoxy nucleotides الييدروكسيل في الموقع يتعذر بعد ذلك أرتباط أي الحد. )الشكل 1(. 2 التي يستخدميا االنزيم عادة في بناء الخيط الجديد وبما انيا تفتقر الى مجموعة لمسكر الخماسي فإذا ما ارتبط أى من ىذه الجزيئات فى شريط DNA فإنو دى أوكسى نيوكميوتيدات الحق وبذلك تقف عممية نمو الشريط DNA عند ىذا
الشكل )1(: مولدات نيوكموتيدات من النوعين dntp, ddntp الخطوات األساسية لمكشف عن تتابع الجزيئات المكونه لممادة الو ارثية بطريقة سنجر و كولسون: اضافة قطعة الدنا القالب DNA template والواجب ان تكون مفردة الخيط. single strand اضافة بادئ Primer ذي نياية حرة من نوع 3-OH مخمق كيماويا ومكمل لمتابع المجاور لقطعة الدنا المكمونو في الناقل )يمكن الحصول عميو تجاريا حيث تتوفر ازواع مختمفة مالئمة لالستعمال مع النواقل M13 المختمفة(. )الشكل 3(. اضافة النيوكميوتيدات من نوع الدى أوكسى نيوكميوتيدات األربعة dntps معممة اشعاعيا. أضافة انزيم بممرة الدنا نوع Klenow fragment الذي يتألف من وحدتين االولى االمامية مسؤولة عن بناء خيوط الدنا اما الجزء االخير فيكون مسؤوال عن تحطيم الدنا اي ليذا االنزيم نشاطين بنائيpolymerase بأتجاه من -5 الى -3 ونشاط انزيمي exonuclease من 2- الى 5-. يقسم خميط التفاعل الى اربعة انابيب متساوية الكميات والت اركيز. اضافة النيوكميوتيدات الداى دى أوكسى نيوكميوتيدات ddntp كل نوع الى انبوبة معينة وليكنddATP الى االنبوبة االولى و ddttp الى االنبوبة الثانية و ddctp الى الثالثة و ddgtp الى االنبوبة االخيرة. من الجدير بالذكر أن البادئ سيحتوي عمى مجموعة (OH) عند ذرة الكربون رقم )2( لجزئى السكر مما يساعد عمى أرتباط أحد جزيئات النيوكميوتيدات المزود بيا التفاعل وبذلك سيبدأ تخميق شريط جديد أمام كل شريط قديم وسيتوالى ترتيب النيوكميوتيدات الجديدة فى بناء األشرطة الجديدة ولكن عممية بناء أى شريط ستتوقف إذا أخذ جزئ داى أوكسى نيوكميوتيد فى بناء الشريط الجديد وحدوث ىذا االحتمال األخير يتم عشوائيا ويؤدى ذلك إلى أن القطع الجديدة ستكون مشعة ومتفاوتة فى أطواليا ولكن كل منيا ينتيى بالداى دى أوكسى نيوكميوتيد في الطرف -2. وبيا وبعد انتياء التفاعل في االنابيب االربعة سنحصل عمى خميط من الدنا الجديدة المختمفة االطوال.1.3.2.4.5.6.7
التي تحتوي جميعا عمى نفس النيوكيوتيد في الطرف 5- تنتيي قسم منيا ب ddatp وقسم اخر ب ddttp وىكذا. ولكنيا تختمف في الطرف -2 حيث.8 تؤخذ قطع ال DNA الناتجة عن عمميات المضاعفة األربع ويجرى ليا فصل كيربائى باستخدام ألواح الجيالتين نوع بولي اكريالمايد وىذا يتم بعمل أربع حفر wells متجاورة فى لوح الجيالتين ليوضع فى كل حفرة قطع DNA التى تنتيى ش ارئطيا بأحد الداى دى أوكسى نيوكميوتيدات ويحضر بطريقة تسمح بفصل حزم الدنا حتى لو كانت مختمفة بمقدار نيوكميوتيد واحد في الطول وغالبا ما يستعمل ليذا الغرض ىالم رقيق جدا )اقل من 5.5 مادة اليوريا التي تعمل عمى مسخ الدنا وفصل الخيوط ممم( كما يضاف لميالم المستعمل الجديدة عن القالب المكمون في الناقل.وألجل منع الخيوط الممسوخة من االرتباط مع بعضيا مرة اخرى يجب رفع درجة ح اررة م 65 اليالم الى او اكثر ويتم لك عن طريق اج ارء الترحيل الكيربائي بااستخدام فولتية عالية. ثم يتم تصوير اليالم بطريقة االشعاعي االتي.Autoradiography.9 تتسم ق ارءة اليالم او صورة اليالم لتحديد تتابع النيوكميوتيدات بسيولة حيث يتم اوال تحديد الحزمة المياجرة ألطول مسافة وىي تمثل اصغر قطعة دنا مخمقة في الخميط وىذا يعني ان نمو ىذه القطعة قد توقف عند النيوكموتيد االول لمقالب ( أي ان شبيو المولد قد اضيف مقابل النيوكموتيد األول لمقالب(. 15. اذا اخدنا يحتوي عمى الشكل ادناه كمثال عمى ىذه الحالة نالحظ ان اصغر حزمة تقع C في المجال ddctp مما يعني ان النيوكموتيد االول في الخيط الجديد ىو من نوع الذي C. الخطوة الثانية ىي تحديد موقع الحزمة المياجرة بمسافة اقل من االولى وتعيين المجال الذي تحركت فيو والتي تكون اطول من الحزمة االولى بمقدار موقع ىذه الحزمة في المجال من النوع T نيوكموتيد واحد فقط. كما يالحظ من الشكل ادناه ايضا مما يشير الى ان النيوكموتيد الثاني في الخميط الجديدىو T. اما الحزمة الثالثة من ناحية مسافة اليجرة فتقع )ddatp وبيذا سيكون النيوكموتيد الثالث من نوع ومجال حركتيا لمعرفة تتابع النيوكموتيدات بالكامل. A في المجال A ( الذي يحتوي عمى وىكذا تستمر الق ارءة لتحديد مواقع الحزم
الشكل )2(: مخطط لطريقة سنجر وكولسون لتحديد تتابع نيوكميوتيدات قطعة دنا.
طريقة ماكسام وجمبرت )طريقة التحمل الكيمياوي(: عمى الرغم من ان ىذه الطريقة التستوجب استعمال نواقل الكمونة المشتقة من العاثي )M13( اال اننا سنتطرق ليا الستكمال الصورة حول تقنيات تحديد تتابع النيوكموتيدات و ليمكن القارئ يقارن بينيا وبين طريقة سنجر و كولسون. ان من تختمف ىذه الطريثة عن سابقتيا اختالفا جوىريا في كيفية تحديد التتابعات فيي تعتمد عمى تكسير خيط الدنا بشكل مدروس بدال عن بناء خيط جديد كما ىي الحال في الطريقة االولى. تتم عممية تكسير الخيوط باستخدام مواد كيماوية معينو تعمل بصورة متخصصة عمى القواعد النتروجينية المختمفة. فكل مجموعة من ىذه المواد الكيماوية تعمل عمى تكسير خيط الدنا عند نوع معين من القواعد النتروجينة منتجة بذلك خميطا من الخيوط التي تختمف بأطواليا بمقدار نيوكموتيد واحد وبعد فصل ىذه الخيوط عمى ىالم البولي اكريالمايد يمكن تحديد تتابع النيوكموتيدات بصورة دقيقة. تجري عممية القطع بمرحمتين حيث تضاف في المرحمة االولى مواد كيمياوية تعمل عمى تحوير نوع معين من القواعد النتروجينية وعند اضافة مادة كيمياوية ثانية ستعمل عمى قطع خيوط الدنا Dimethyl sulfate N7 في مواقع تمك القواعد المحورة مثال عمى تحوير القاعدة G من ىذه القاعدة وبيذا سيكون خيط الدنا مثل الببريدين,Piperidine وىكذا لبقية انواع القواعد النتروجينية. الخطوط العريضة ليذه التقنية مجموعة فوسفات معممة ب P 32 ىي ان الى الطرف فصل خيطي الحمزون عن بعضيا باضافة الخميط الى تعمل مادة السمفات ثنائية عن طريق اضافة مجموعة مثيل الى المثيل الموضع قابال لمكسر عند ىذه القاعدة بعد اضافة مادة ثانية تعمم اوال قطعة الدنا 5 مزدوجة الخيط قيد الدرس بإضافة لكل خيط من خيطي الحمزون Dimethyl sulphoxide الخطوة الثانية ىي )DMSO( 95 الحمزون. م وتسخين حيث تودي ىذه المعاممة الى تكسير االواصر الييدروجينة التي تربط خيطي يستخدم بعد ذلك الترحيل الكيربائي في ىالم البولي اكريالمايد لفصل خيطي الحمزون والحصول عمى احدىما بصورة نقية. وعمى الرغم من ان خيطي الحمزون متماثالن بالطول اال انيما يختالف في الثقل وذلك الن احدىما سيكون غنيا بالبيورينات بالبرميدينات C,T A,G فيما يكون االخر غنيا وبما ان البيورينات ىي اثقل من البرميدينات فان الخيط االول سيكون اثقل من الثاني وبالتالي سيتحرك الى مسافة اقل عمى اليالم. تستخمص حزمة الخيط الثقيل ( المعمم اشعاعيا في الطرف ( 5 معين من القواعد النتروجينية من اليالم وتقسم الى اج ازء 4 يستعمل كل واحد منيا لتعيين مواقع نوع فيستعمل الجزء االول عمى سبيل المثال لتحديد موقع كل وذلك G باضافة مواد كيمياوية تعمل عمى تحوير ىذه القاعدة ومن ثم كسر الخيط عند الموضع المحور عمما ان ظروف التفاعل يجب ان تضبط بحيث ال يزيد عدد الكسور في الخيط عمى واحد او
اثنين في الطرف سينتج عن عممية التكسير مجموعة 2 من الخيوط المختمفة االطوال تنتيي جميعا بالقاعدة G تكرر العممية مع االج ازء الثالثة االخرى باستعمال مواد كيمياوية خاصة لكل قاعدة نتروجينية بحيث تقطع خيوط الدنا في كل انتياء التفاعل لالج ازء االربعة ستتكون مجموعة من خيوط الدنا جميعا بنفس النيوكموتيد في الطرف ينتيي بالقاعدة 5 G وقسم اخر بال... A الخ. جزء عند مواضع قاعدة نتروجينة معينة. بعد المختمفة االطوال التي تشترك ( المعمم اشعاعيا( ولكنيا تختمف في الطرف 2, فقسم منيا تفصل الخيوط المفردة لكل تفاعل حسب اطواليا عمى ىالم البولي اكريالمايد وتحدد مواقع الحزم المشعة بواسطة التصوير االشعاعي الذاتي الذي أ يقر االسموب المتبع في طريقة سنجر وكولسون )الشكل 2(. فيما بعد لتحديد تتابع النيوكموتيدات وبنفس
الشكل )3(: مخطط لطريقة ماكسام وجمبرت لتحديد تتابع نيوكميوتيدات قطعة دنا.